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Técnicas Utilizadas para Identificar e Isolar as Bactérias e Meios de Cultura

Coloração de Gram: é possível diferenciar bactérias Gram-negativas (vermelhas ou cor de rosa) de Gram-positivas (cor púrpura) pela capacidade de reter ou não o corante principal, cristal violeta, quando submetido a um tratamento descorante.

Composição Genética: a composição do material genético (DNA) é único para cada espécie.

Semeadura por esgotamento: utilizado para obtenção de colônias puras. Consiste em isolar a colônia de interesse em uma nova placa de petri.

Urinocultura Quantitativa: consiste no diagnóstico de infecção urinária, através da contagem das colônias bacterianas presentes no meio de cultura (CLED).

Crescimento: utilizando-se de meios de cultura, pode-se através da observação das características ( tamanho, cor, forma das colônias) produzidas por uma determinada espécie bacteriana, em cultura, variam com a composição do meio.

Atividades Bioquímica e Metabólica: durante o seu crescimento as bactérias produzem enzimas, produtos e secreções. Algumas espécies produzem ácidos sulfídrico, oxigênio, que permite à sua identificação.

SÉRIES BIOQUÍMICAS: através da verificação das transformações químicas que ocorrem no substrato pela ação do microrganismo pode-se identificar a bactéria. Baseia-se na utilização de carboidratos como fonte principal de energia, na decomposição de compostos nitrogenados (produção de indol, desdobramento da uréia, produção de gás sulfídrico). A série é composta por vários meios de cultura TSI, CITRATO, LISINA, URÉIA, GLICOSE E TESTE DE MOBILIDADE

Meios de cultura: são meios específicos para cultivar microrganismos, constituídos por substâncias que satisfazem as necessidades nutricionais dos microorganismos (PELCZAR, 1997).

Importância: Na microbiologia clínica ou de saúde pública é frequentemente necessária a determinação da presença de um microorganismo específico associado com doença ou com condições de pouca sanidade.

MEIOS SELETIVOS: são elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento da bactéria de interesse impedindo o crescimento de outras bactérias. Exemplos: Manitol e MacConkey

Manitol: é um meio salino (7,5% de Cloreto de Sódio) com indicador de pH que provoca mudança da sua cor quando o manitol é fermentado e produzindo ácido, a única espécie capaz de realizar esta tranformação da coloração do meio é Stafhylococcus aureus

MEIO DIFERENCIAL: permite a diferenciação de organismos que cresce no meio, facilita a identificação da bactéria de interesse quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa do meio de cultura.

Exemplos: Agar Sangue, contém células vermelhas do sangue, é muito utilizado pelos microbiologistas para identificação de espécies bacterianas capazes de destruir células sanguíneas. Ex: Staphylococcus.

MEIO SELETIVO E DIFERENCIAL: Podem esta combinadas as duas características no mesmo meio, são utilizados para a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse.
MacConkey: contém sais biliares e cristal violeta que são inibidores do crescimento de bactérias gran-positivas. Contém também lactose que permite diferenciar bactérias fermentadoras gram-negativas capazes utilizar lactose (colônias vermelhas ou rosas) daquelas que não a utilizam (colônias incolores)

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Coloração de Gram

Preparo do esfregaço

Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

Aplicação do corante primário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso de corante ou enxaguar a lâmina com água.

Aplicação do fixador

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso do fixador ou enxaguar a lâmina com água.

Descoloração

Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este procedimento não pode exceder a cinco segundos, pois o descolorizador poderá remover o corante cristal violeta das células Gram-positivas. Em seguida, enxaguar a lâmina com água para remover excesso de solvente.

Aplicação do corante secundário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica; deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

Microscopia

Examinar a amostra ao microscópio óptico. Na aplicação da técnica de coloração de Gram de organismos desconhecidos, pode-se utilizar como controles uma bactéria Gram-positiva e uma Gram-negativa, conhecidas, preparando-se lâminas com três esfregaços, sendo o esfregaço central o da bactéria desconhecida. Desta forma, as bactérias controles indicarão se a técnica foi ou não bem sucedida. Sugere-se utilização de Bacillus subtilis e Escherichia coli como controles Gram positivo e Gram negativo, respectivamente.

fonte:http://www.fam.br/microrganismos/metodo_coloracao_de_gram.htm

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