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Prova da utilização do citrato


Permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como única fonte de carbono.A prova é feita no meio de citrato ou meio de Simmons. Na ausência de glicose ou lactose fermentáveis, alguns microrganismos são capazes de usar o citrato como única fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presença de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da célula o citrato é degradado pela enzima citrase, produzindo ácido oxalacético e acetato. Estes produtos são depois convertidos enzimaticamente em ácido pirúvico e CO2. O meio de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova é feita em tubos em rampa, uma vez que o O2 é necessário para a utilização do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertação de CO2. Durante esta reação o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sódio (fornecido pelo citrato de sódio) e água para formar carbonato de sódio, que é um produto alcalino. A presença de carbonato de sódio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte. Após incubação, as culturas citrato positivo são identificadas pela presença de crescimento, na superfície da rampa, acompanhado de coloração azul no meio de cultura. Nas culturas citrato negativas a cor do meio mantém-se verde e não apresentam crescimento no meio de cultura.

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Prova de Voges-Proskauer VP



O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos ácidos orgânicos que resultam da metabolização da glicose. Prova feita no meio MR VP (Methyl Red, Voges Proskauer).

A adição do reagente de Barritt’s (solução 40% KOH e solução de

Este tipo de fermentação da glicose é característico do E.aerogenes.

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Prova do Indol


O objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol.
O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é mediada pela enzima triptofanase.
Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos serve como marcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol.
Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano por ex.: água peptonada. Após o crescimento pesquisa-se a presença de indol adicionando o reagente de Kovac’s (cor amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado.
As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do reagente são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa.

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Prova de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron Agar TSI


Esta prova é, geralmente, usada para diferenciar os diferentes géneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta família de outros bacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferenciação é feita atendendo às diferenças na fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S). Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contêm glicose em pequena concentração (0,1%), lactose em concentração superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produção de ácidos resultantes da fermentação dos hidratos de carbono, tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H2S, e sulfato de ferro para a detecção desse produto final. A diferença entre estes dois meios diferenciais é que o TSI possui mais um açúcar, a sacarose, em concentração igual à da lactose (1%). Ambos os meios são inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. É essencial que as culturas sejam observadas após 18 a 24 h de incubação para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradação das peptonas, formando produtos finais alcalinos. É na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S. Após incubação podem ser determinadas as actividades fermentativas, a produção de gás e a produção de H2S, podendo ocorrer vários resultados: Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha): Só a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato está presente em concentração mínima, a quantidade de ácido produzida é limitada e é rapidamente oxidada na superfície da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio são também usadas na produção de substâncias alcalinas. No cilindro, a reacção ácida é mantida devido à tensão reduzida do oxigénio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido à persistência da formação de ácido no cilindro. Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela): Ocorreu a fermentação da lactose e/ou da sacarose, para além da glicose. Como as duas primeiras substâncias estão presentes em altas concentrações são substratos para a actividade fermentativa contínua com manutenção da reacção ácida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro). Produção de gás: Nota-se pela ocorrência de fracturas no meio de cultura. Produção de H2S: Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermédia do cilindro. Isto deve-se ao facto do microrganismo em estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrogénio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo insolúvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterado (tijolo): Não ocorreu fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produção de gás ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condições anaeróbias e/ou aeróbias, resultando num pH alcalino devido à produção de amónia. Se só ocorrer degradação aeróbia das peptonas, a reacção alcalina só é evidenciada na superfície da rampa. Se houver degradação aeróbia e anaeróbia das peptonas, a reacção alcalina é visível em todo o meio.

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